Introdução: O cirurgião-dentista pode ser um facilitador na transmissão de microrganismos, devido ao contato com a microbiota do paciente. Portanto, a busca por materiais que auxiliem na biossegurança é relevante. Objetivo: Avaliar a contaminação de hidrocolóides irreversíveis contendo e não contendo clorexidina, além de quantificar e qualificar o gênero dos microrganismos. Metodologia: Trata-se de um ensaio clínico de boca dividida duplo cego. Para isso, 24 voluntários assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), além de um controle negativo, totalizando 50 amostras. A ordem de participantes foi randomizada e codificada. A moldagem seguiu da seguinte forma: em metade da moldeira foi disposto o alginato contendo clorexidina Avagel (Dentisply, Milford, DE, EUA) e em outra o alginato não contendo clorexidina Ezact Kromm (Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Na coleta, swabs estéreis percorreram a oclusal de pré-molares e molares dos moldes, sendo inoculados em caldo BHI por 24 horas a 37°C e, posteriormente, distribuídos em placas de petri contendo ágar nutriente por 24 horas a 37°C. A contagem de Unidade Formadora de Colônia (UFC) teve como ponto de corte 350. Foram realizadas lâminas microscópicas pela técnica da coloração de Gram, teste da catalase e de KOH, sendo analisadas de forma qualitativa para identificação do gênero. Resultados: Na análise quantitativa, não se identificou diferenças estatísticas entre o grupo com e sem clorexidina pela contagem de UFCs (p=0,423). A qualitativa também não identificou diferença quanto ao tipo de microrganismo encontrado (p=0,070). Staphylococcus prevaleceu em ambos os grupos. Observou-se a predominância de bactérias Gram negativo no grupo sem clorexidina e colônias fúngicas no com clorexidina. Conclusão: Não houve diferença quanto a contaminação entre materiais. O predomínio de colônias fúngicas no grupo com clorexidina e a predominância de Staphylococcus destacam a complexidade da microbiota oral e necessidade de rigorosas práticas de desinfecção.