Introdução: A Anatomia Dental é fundamental para o ensino da Odontologia, permitindo que os alunos desenvolvam um olhar clínico e técnico para a identificação de estruturas dentárias. Os alunos apresentam muitas vezes dificuldades na diferenciação entre primeiros e segundos prémolares superiores durante o estudo da Anatomia Dental. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo morfológico e comparativo entre primeiros (PPMS) e segundos (SPMS) pré-molares superiores, evidenciando características anatómicas que favoreçam a sua correta identificação. Método: Foram analisados 100 PPMS e 100 SPMS do acervo didático da Disciplina de Anatomia, após aprovação do comitê de ética (CAAE: 69100723.3.0000.5416). Foram feitas mensurações com paquímetro digital e observações visuais das estruturas dentárias. Os dados foram analisados estatisticamente com testes t de Student e Qui-quadrado (p<0,05). Resultado: Os PPMSs apresentaram cúspides maiores, a vestibular com valor médio de 8,45mm e 7,32mm para a palatina, e sulco principal mais longo e deslocado para lingual. Em 79% dos PPMSs, foi possível observar a fossa cervical mesial, enquanto nos SPMSs esse número foi de apenas 4%. Os SPMSs apresentaram o sulco principal mais curto, centralizado na face oclusal e sulcos secundários mais frequentes. Em relação às raízes, a maior frequência tanto nos PPMSs (61%) e SPMSs (68%) foi de dentes unirradiculares, o que demonstra que o número de raízes não é um aspecto de diferenciação entre esses dentes. A posição da cúspide lingual mesializada foi frequente tanto em PPMSs (96%), como nos SPMSs (89%), sendo útil para identificar o lado do dente. Conclusão: Os resultados deste estudo evidenciaram que os primeiros e segundos pré-molares superiores apresentam dimensões e características morfológicas que facilitam a sua distinção, contribuindo para esclarecer dúvidas quanto à sua anatomia. Enquanto algumas estruturas se revelam mais constantes e padronizadas, outras demonstram variações importantes, o que também favorece uma identificação mais precisa desses dentes.