Introdução: Dentre as diversas substâncias utilizadas no tratamento endodôntico, a N-acetilcisteína (NAC) tem despertado interesse na odontologia regenerativa devido à sua ação antioxidante e antimicrobiana, podendo favorecer a recuperação de tecidos pulpares. Objetivo: Avaliar, in vitro, o impacto da NAC na resposta biológica de células-tronco da polpa dentária (DPSCs), com foco em sua viabilidade e proliferação, visando seu uso como composto bioativo de baixa toxicidade em terapias regenerativas. Metodologia: Foram utilizadas duas linhagens humanas de DPSCs (primária e imortalizada), cultivadas em meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) com NAC em três concentrações (0,01; 0,1 e 1 mg/mL), submetidas a períodos de exposição de 24 e 48 horas estabilizando ou não o pH da NAC com Hidróxido de Sódio (NAOH). A viabilidade celular foi mensurada por meio do ensaio com vermelho sulforródamina B (SRB), que avalia a viabilidade celular com base na ligação do corante às proteínas celulares. Resultado: A análise demonstrou que a NAC contribui para a manutenção da viabilidade celular, sem apresentar efeitos citotóxicos, com desempenho semelhante entre as linhagens testadas. Em todas as concentrações testadas, a NAC com pH estabilizado não apresentou citotoxicidade e contribuiu para a viabilidade celular das DPSCs. Considerando uma concentração intermediária que alie biocompatibilidade e eficácia antimicrobiana, a concentração de 0,1 mg/mL foi determinada como a mais adequada após ensaio de viabilidade celular pelo teste de SRB. Conclusão: Os achados indicam que a NAC tem potencial de ser uma opção segura e eficiente na endodontia regenerativa, com destaque para a concentração de 0,1 mg/mL com estabilização do pH que apresentou os resultados mais adequados in vitro.