Introdução: Estratégias de engenharia tecidual associam scaffolds e moléculas sinalizadoras para modular a diferenciação celular e otimizar a regeneração tecidual. Objetivo: Avaliar o efeito de hidrogéis de Pluronic F-127 (P) e colágeno (Col) associados ao ácido ascórbico (AA) e ácido retinoico (AR) sobre células da papila apical humana (hAPCs), visando a promoção da regeneração endodôntica. Material e método: hAPCs foram obtidas de molares humanos hígidos (n=4) e a cultura foi caracterizada por citometria de fluxo. Após seleção inicial, AR 0,1 µM e AA 300 µM foram incorporados, isolados ou associados, ao hidrogel P25% ou Col. Os grupos (n=10): Col (controle), Col+AA, Col+AR, Col+AA+AR, P25%, P25%+AA, P25%+AR, P25%+AA+AR foram avaliados em cocultura de hAPCs com células endoteliais (HUVECs) quanto à viabilidade celular (alamarBlue, 1, 3 e 7d), formação de matriz mineralizada (Alizarin Red, 14d), síntese de colágeno total (Sirius Red, 7 e 14d) e migração celular ativa (Transwell, 1d), por contato indireto. A expressão de genes de interesse para regeneração endodôntica (RT-qPCR; COL1A1, COL3A1, CXCL12, VEGFA, ITGAV; 1d) foi avaliada inserindo os biomateriais em segmentos radiculares de incisivos bovinos para avaliação da resposta celular in situ (n=6). Os dados foram analisados com ANOVAs e pós-testes específicos (α=5%). Resultados: A maioria das hAPCs da cultura primária expressou marcadores para células mesenquimais indiferenciadas (≥62,3%). Col+AA, Col+AR e Col+AA+AR aumentaram a viabilidade celular em relação ao controle (p<0,05). P25%+AR aumentou a síntese de colágeno total e P25%+AA+AR aumentou a formação de matriz mineralizada (p<0,05). No modelo in situ, modulação da expressão gênica foi observada para Col+AA, Col+AR, PL25%+AR+AA e P25%+AR (p<0,05). Conclusão: Células da cocultura hAPCs e HUVECs foram bioestimuladas por AR 0,1 µM e AA 300 µM e a associação das moléculas a hidrogéis de P ou Col resultou em biomateriais com potencial para procedimentos de regeneração endodôntica.