Introdução: Produtos contendo fosfatos orgânicos e inorgânicos em sua formulação vem demonstrando ser uma estratégia viável para o aumento da eficácia de dentifrícios fluoretados. Objetivo: O objetivo do estudo foi avaliar, in situ, a capacidade de uma nova formulação dentifrícia contendo fluoreto (F), trimetafosfato de sódio (TMP) e fosfopeptídeo de caseína fosfato de cálcio amorfo (CPP-ACP) em reduzir a desmineralização do esmalte dentário bovino. Material e Método: Voluntários (n=10) utilizaram dispositivos palatinos contendo 4 blocos de esmalte bovino durante 7 dias em 5 fases experimentais, com os respectivos dentifrícios: 1) sem F-CPP-ACP-TMP (Placebo), 2) 1100 ppm F (1100F), 3) 1100F + 3% TMP (1100F-TMP), 4) 1100F + 10% CPP-ACP (1100FCPP-ACP) e 5) 1100F-CPP-ACP-TMP. Os desafios cariogênicos foram produzidos pelo uso de uma solução de sacarose a 30%, 6x/dia. Após 7 dias determinou-se a dureza de superfície final (SHf) para o cálculo da porcentagem de perda de dureza de superfície (%SH), perda integrada de dureza de subsuperfície (ΔKHN) e concentração de polissacarídeo extracelular insolúvel (EPS) no biofilme. Os dados foram submetidos a ANOVA (1-critério) de medidas repetidas, seguido pelo teste Student-Newman-Keuls (p < 0,001). Resultados: A adição do CPP-ACP-TMP ao dentifrício convencional (1100F), reduziu a desmineralização do esmalte em 43% e 41% quando comparado aos tratamentos 1100F e 1100F-CPP-ACP (p < 0,001), respectivamente, além de uma redução no corpo da lesão em 36% quando comparado aos mesmos tratamentos (p < 0,001). Ainda, o tratamento com 1100F-CPP-ACP-TMP reduziu a concentração de EPS em ⁓ 52,6 quando comparado ao tratamento convencional (1100F) (p < 0,001). Conclusão: Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que a formulação dentifrícia contendo 1100F-CPP-ACP-TMP demonstrou um maior efeito protetor contra a desmineralização do esmalte dentário e afetou significativamente a composição do biofilme formado in situ.