O objetivo deste estudo foi desenhar e padronizar in vitro a especificidade de primers para os genes ERG1, ERG3, ERG11 e ERG25 relacionados com a síntese de ergosterol, que é um importante componente da membrana celular de Candida spp. A análise in silico foi realizada através de uma pesquisa no PubMed de artigos com seqüências de primers para os genes de interesse. A análise das estruturas secundárias foi realizada usando Mfold. Os primers que não apresentaram características satisfatórias (ausência de estruturas secundárias, Tm não discrepantes entre a sequência forward e reverse e tamanho inadequado) após análise foram desenhados usando o programa Oligo Explorer™ através de seqüências obtidas a partir do Pubmed (sequência FASTA). Os primers foram sintetizados e testados in vitro pela técnica de PCR utilizando um painel deDNA genômico de diferentes espécies de Candida (C.  albicans, C. glabrata, C. dubliniensis, e C. tropicalis), com seus produtos visualizados em gel de agarose. Reações de qPCR foram realizadas para determinar a concentração ótima e a eficiência dos primers. Em relação a especificidade, os primers para os genes ERG1 e ERG3 foram específicos para C. albicans e C. dubliniensis. Já o primer para o gene ERG25 foi específico para todas as espécies de Candida testadas, exceto C. glabrata. O primer para o gene ERG11 foi específico para todas as espécies testadas. Após a otimização, todos os primers apresentaram um único pico, coeficiente de correlação de≅1 e eficiência de reação de qPCR de 90-110%, com slope de≅− 3.3. Portanto, esses primers são adequados para análises de expressão gênica in vitro e in vivo, desde que não apresente contaminação com outras espécies de Candida.