Introdução:  A raspagem e alisamento radicular são mecanismos eficazes no tratamento da doença periodontal, entretanto, em alguns casos, parece não ser capaz de devolver ou manter a saúde periodontal. Alternativas terapêuticas vêm sendo desenvolvidas e entre elas, a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) que utiliza fonte de luz (LED/ LASER) e agente fotossensibilizador. Objetivo: O estudo avaliou in vitro o efeito antibacteriano da aPDT utilizando o fotossensibilizador azul de metileno em cultura de microrganismos anaeróbios Gram negativos. Material e método: Culturas de bactérias foram realizadas com biofilme monoespécie: Streptococcus oralis (ATCC 35037) e Aggregatibacter actinomycetemcomitans (JP2 43718) em placa de cultura (48 poços) e mantidos à 37o C por 24 horas em anaerobiose. Após a formação do biofilme, o meio de cultura foi removido cuidadosamente e foi realizado a fotoinativação dos microrganismos de acordo com grupos experimentais:  Grupo 1 (C):  Solução Salina (500u), Grupo 2 (CHX): Microrganismo + Clorexidina, Grupo 3 (LED Vermelho): Microrganismos + PBS + Irradiação com LED Vermelho, Grupo 4: Azul de Metileno (Az), Grupo 5: Azul Metileno + Luz Vermelha (aPDT). Foi realizada a contagem de colônias formadas. Os dados foram analisados estatisticamente com nível de significância de 95%. Resultados:  Os resultados obtidos demonstraram que para o microrganismo S.  oralis a aPDT apresentou menor formação de colônia que os grupos clorexidina, azul de metileno e LED (p<0,05). Conclusão:  A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana com azul de metileno apresenta efeito antibacteriano em cultura de microrganismos anaeróbios gram negativos.