RESUMO: O objetivo do estudo foi avaliar a eficácia clareadora e os efeitos biológicos da ativação enzimática em um gel com 10% de peróxido de hidrogênio (H2O2) aplicado sobre discos de esmalte/dentina que simulavam incisivos humanos inferiores (II) ou superiores (IS). Para isso, a enzima peroxidase (HRP) foi adicionada a um espessante experimental (EP) misturado ao gel ou a um primer polimérico (PR). Os géis foram aplicados por 45 min sobre discos de esmalte/dentina com espessuras de 2,3mm (II) ou 3,5mm (IS). Foram obtidos os seguintes grupos para ambas as espessuras - CN: sem tratamento (controle negativo); CP: 35%H2O2 (controle positivo); PH: 10%H2O2; EP: EP+HRP+10%H2O2; e PR: PR+HRP, aplicado sobre o esmalte imediatamente antes do gel com 10%H2O2. Os  discos foram adaptados em câmaras pulpares artificiais (n=6) e, após o clareamento, o meio de cultura em contato com a dentina foi aplicado sobre células pulpares humanas. A viabilidade celular, estresse oxidativo, difusão de H2O2 residual e alteração de cor dos discos (ΔE) foram avaliados (ANOVA/Tukey; α=5%). O grupo EP apresentou menor efeito citotóxico comparado aos grupos CP e PR (p<0,05); porém, não houve diferença para estes parâmetros testados em II e IS, bem como para os valores de ΔE (p<0,05). A difusão de H2O2 residual foi menor nos grupos EP para II e IS, em comparação ao CP (p<0,05). Conclui-se que a adição da enzima peroxidade em um gel clareador com 10%H2O2 reduz a difusão trans-amelodentinária desta espécie reativa, limitando a toxidade do produto e mantendo sua eficácia clareadora.