O objetivo deste estudo foi investigar a influência do período de tratamento na susceptibilidade de biofilmes de Candida albicans e Candida glabrata às nanopartículas de prata (NPs). NPs (5 nm) foram sintetizadas através da redução do nitrato de prata pelo citrato de sódio. Biofilmes de Candida foram formados sobre a superfície de espécimes de resina acrílica por 48 horas e expostos às NPs (54 μg/mL) por 5 e 24 horas. A eficácia de cada tratamento foi avaliada através da quantificação da biomassa total e das unidades formadoras de colônias (UFCs). Os dados foram analisados estatisticamente através da ANOVA seguida do Teste de Bonferroni (α = 0,05). Tratamentos com NPs por 5 e 24 horas promoveram reduções significativas (p < 0,05) na biomassa dos biofilmes de Candida, variando de 35,8‑51,5% e de 17,6-32,3%, respectivamente. Ainda, os tratamentos com NPs por 5 e 24 horas resultaram em reduções significativas no número de UFCs para C. albicans 324LA/94 (redução de 1,44‑log10, p < 0,001) e C. glabrata D1 (redução de 0,71-log10, p = 0,034), respectivamente. Comparação entre os dois períodos de tratamento foi significante somente para C. albicans 324LA/94 (p < 0,001), com melhores resultados para o período de tratamento mais curto (5 horas). Conclui-se que os períodos de tratamento não foram decisivos na susceptibilidade às NPs e o tratamento por 5 horas pode ser clinicamente vantajoso. Estes resultados são importantes para o desenvolvimento de novas terapias com o intuito de prevenir a estomatite protética associada à Candida