A utilização de soluções irrigadoras antimicrobianas tem grande importância na desinfecção dos canais radiculares. O objetivo do estudo foi avaliar a atividade antibiofilme de soluções irrigadoras associadas à cetramida, uma substância detergente. Biofilme de Enterococcus faecalis foi induzido por 14 dias sobre blocos de dentina bovina. Os grupos foram: G1: hipoclorito de sódio (NaOCl) 2,5%; G2: NaOCl 2,5% + cetramida (CTR) 0,2%; G3: clorexidina (CHX) 2%; G4: CHX 2% + CTR 0,2%; G5: CTR 0,2%; G6: QMiX. O teste antibiofilme foi realizado por contato direto entre as soluções ou associações ao biofilme bacteriano por 1 ou 3 minutos. Após cada período, os blocos de dentina com o biofilme remanescente foram imersos em soluções neutralizantes para inativar a atividade antibacteriana das soluções avaliadas. Foram realizadas diluições decimais seriadas e plaqueamento em Tryptic Soy Agar. Após 24 horas a 37°C, foi realizada a contagem de UFCmL–1. NaOCl eliminou 100% dos micro-organismos. A CHX apresentou ação semelhante à CTR e QMiX após 1 min, independente da associação com CTR, sendo comparável à NaOCl após 3 min. CTR e QMiX não mostraram diferença entre si. Conclui-se que NaOCl é o único irrigante capaz de eliminar biofilme após 1 e 3 min e a adição de CTR não altera a efetividade antibiofilme das soluções irrigadoras.