A esterilização do esmalte dental é necessária antes de sua utilização em estudos in situ e in vitro. Os objetivos deste estudo foram avaliar a efetividade da irradiação por microondas por 5, 4 e 3 minutos na esterilização do esmalte bovino e sua influência sobre a microdureza superficial. Oitenta amostras de esmalte bovino foram divididas em 4 grupos (n = 20): I – Controle e II, III e IV – Irradiados por microondas a 650 W por 5, 4 ou 3 minutos. Após a irradiação, foi realizada análise microbiológica, sob condições de aerobiose e anaerobiose. Outras 30 amostras de esmalte bovino (4 × 4 mm), foram embutidas, seccionadas ao meio e divididas em 6 grupos (n = 10): 3 Grupos Controle – não irradiados (I, II e III) e 3 Grupos Irradiado (I, II e III –5, 4 ou 3 minutos a 650 W). Foi realizado teste de microdureza superficial Knoop (5 impressões; 25 gf por 5 segundos). O teste t - Student foi utilizado para análise estatística. O crescimento microbiológico foi observado apenas nas amostras do grupo controle. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes nos valores de microdureza entre as amostras controle e aquelas submetidas à irradiação. Foi possível concluir que a irradiação por microondas por 5, 4 ou 3 minutos a 650 W são métodos eficientes para a esterilização de esmalte bovino e não promovem alterações na microdureza superficial. Apoio: PIBIC/CNPq